Как екстрактът от Пория Кокос облекчава чернодробната стеатоза.
- Мартин Кръстев
- May 8, 2024
- 29 min read
Updated: May 9, 2024
Poria cocos Wolf (PCW) е ядлива фармацевтична гъба със забележителни биологични свойства, включително противотуморни, противовъзпалителни, антиокислителни, против стареене и антидиабетни ефекти. В настоящото проучване ние изследвахме ефектите на екстракта от PCW върху чернодробната стеатоза при in vitro и in vivo условия и изяснихме основните механизми. В това проучване е използвана смес от HepG2 клетки, третирани със свободна мастна киселина (FFA) - палмитинова и олеинова киселина - и хранени с високо съдържание на мазнини (HFD) затлъстели мишки; на този фон бяха измерени нивата на триглицеридите (TG) в HepG2 клетките и черния дроб на мишки и бяха определени нивата на експресия на гени, свързани с липогенезата, окислението на мастни киселини, стреса на ендоплазмения ретикулум (ER) и автофагията. Третирането на HepG2 клетки с FFA повишава вътреклетъчните нива на TG в HepG2 клетките, но съвместното лечение с PCW значително отслабва нивата на TG. Трябва да се отбележи, че PCW значително повишава фосфорилирането на AMP-активирана протеин киназа (AMPK), ацетил-CoA карбоксилаза (ACC) и стерол регулаторен елемент-свързващ протеин-1c (SREBP-1c) в третирани с FFA HepG2 клетки. PCW регулира надолу експресията на гени, свързани с липогенезата, но повишава експресията на гени, свързани с окисляването на мастни киселини. Освен това, PCW инхибира индуцираната от FFA експресия на ER стрес маркери и индуцирани протеини на автофагия. Въпреки това, инхибирането на AMPK значително отслабва благоприятните ефекти на PCW в HepG2 клетки. Освен това, PCW ефективно намалява индуцираното от HFD чернодробно натрупване на TG in vivo и повишава фосфорилирането на чернодробния AMPK. Три съединения, присъстващи в PCW, включително пориконова киселина, пахиминова киселина и ергостерол, значително намаляват индуцираното от FFA повишаване на вътреклетъчните нива на TG, в съответствие с повишеното фосфорилиране на AMPK, което предполага, че порикоевата киселина, пахиминовата киселина и ергостеролът са отговорни за медиираното от PCW подобряване на чернодробна стеатоза. Взети заедно, тези резултати показват, че PCW подобрява чернодробната стеатоза чрез регулиране на липидния метаболизъм, инхибиране на ER стреса и активиране на автофагията по AMPK-зависим начин. Това предполага, че PCW може потенциално да се използва за лечение на чернодробна стеатоза.
1. Въведение
Неалкохолното мастно чернодробно заболяване (NAFLD) е най-честата причина за чернодробни проблеми, вариращи от чернодробна стеатоза до по-тежки заболявания, включително неалкохолен стеатохепатит (NASH), фиброза, цироза и чернодробен карцином [ 1 ]. Чернодробната стеатоза е първата стъпка в развитието на NAFLD и се характеризира с прекомерно натрупване на триглицериди (TG), причинено от следното: повишена de novo липогенеза, намалено β-окисление на мастни киселини в черния дроб, износ на липопротеини с много ниска плътност (VLDL) от черния дроб и продължаваща липолиза в адипоцитите [ 2 ]. NAFLD води до развитието на много метаболитни заболявания като затлъстяване, диабет тип 2, инсулинова резистентност и хипертриглицеридемия [ 1 ]. Следователно, разработването на средства, способни да облекчат чернодробната стеатоза, може да представлява терапевтичен подход към лечението на чернодробни нарушения, специфично свързани с NAFLD. Въпреки това, досега няма ефективна и безопасна терапия срещу NAFLD, с изключение на няколко интервенции, насочени към затлъстяването и медиирана от начина на живот загуба на тегло. Много диетични фитохимикали привлякоха внимание за лечението на NAFLD, тъй като използването на фитохимикали се счита за алтернативна стратегия за разработване на ефективни и безопасни лекарства срещу NAFLD [ 3 ].
AMP-активираната протеин киназа (AMPK) е серин/треонин киназа, която играе критична роля в енергийната хомеостаза и усещането за хранителни вещества и се активира от нисък клетъчен енергиен статус [ 4 ]. AMPK съществува като хетеротримерен комплекс, включващ каталитична субединица (α) и две регулаторни субединици (β и γ) и се експресира в почти всички тъкани. AMPK се активира чрез фосфорилиране на Thr172 остатъка в α субединицата [ 4 ]. Активирането на AMPK инхибира процесите, консумиращи АТФ, включително синтеза на мастни киселини и глюконеогенезата, докато стимулира процесите, генериращи АТФ, като окисление на мастни киселини и гликолиза [ 4 ]. Следователно AMPK е вероятна терапевтична цел за лечение на метаболитни заболявания, включително затлъстяване, инсулинова резистентност, диабет тип-2, NAFLD и сърдечно-съдови заболявания (CVD).
Активирането на AMPK подобрява чернодробната стеатоза чрез множество механизми [ 5 , 6 , 7 ]. Активирането на AMPK инхибира синтеза на мастни киселини (липогенеза), докато стимулира окисляването на мастни киселини. Активирането на AMPK води до фосфорилиране и инактивиране на ацетил-CoA карбоксилаза (ACC), като по този начин води до понижени нива на малонил-CoA, прекурсор на синтеза на мастни киселини, мощен инхибитор на карнитин палмитоилтрансфераза-1 (CPT-1) и ензим, ограничаващ скоростта на окисляване на мастни киселини. По този начин, намаляването на нивата на малонил-CoA чрез активиране на AMPK води до намалена липогенеза и повишено окисление на митохондриални мастни киселини. Освен това активирането на AMPK директно фосфорилира стерол регулаторния елемент-свързващ протеин 1c (SREBP1c) при Ser372, главен транскрипционен фактор на липогенезата, като същевременно инактивира неговата транскрипционна активност, което води до потискане на гени, участващи в липогенезата, като синтаза на мастни киселини ( FAS ), стеароил-коензим А десатураза 1 ( SCD1 ) и ACC1 . Следователно антилипогенезната активност на AMPK прави този ензим потенциална терапевтична цел за лечение на чернодробна стеатоза.
AMPK инхибира липид-индуцирания ER стрес и натрупването на TG в хепатоцитите [ 6 ]. Продължителните състояния на стрес на ендоплазмения ретикулум (ER), при които хомеостазата на ER не се възстановява, се характеризират с повишена експресия на ключови маркери, като глюкозо-регулиран протеин 78 (GRP78), C/EBP хомоложен протеин (CHOP) и подобен на фосфорилиран протеин киназа ER киназа (p-PERK), които индуцират чернодробна стеатоза [ 8 ]. ER стресът увеличава чернодробната липогенеза, инхибира сглобяването и секрецията на VLDL, индуцира експресията на VLDL рецептор и насърчава инсулиновата резистентност [ 8 ]. По този начин защитата срещу продължителен ER стрес може да служи като добра стратегия за лечение на чернодробна стеатоза.
AMPK потиска натрупването на чернодробни липиди чрез стимулиране на аутофагия, катаболен процес, който премахва дисфункционалните макромолекули и органели чрез лизозомно разграждане [ 7 ]. Автофагията играе критична роля в хидролизата на вътреклетъчните липидни капчици за поддържане на липидната хомеостаза - феномен, обикновено наричан липофагия [ 9 ]. Активирането на AMPK регулира положително аутофагията чрез потискане на мишената на бозайниците на сигнализирането на рапамицин (mTOR), което е инхибитор на аутофагията [ 10 ]. Много биоактивни съединения, пречистени от лечебни билки, водят до намаляване на натрупването на чернодробни липиди чрез AMPK активиране [ 3 ]. Следователно, последните изследвания са фокусирани върху активирането на аутофагията и развитието на AMPK активатори като обещаващи стратегии за лечение на чернодробна стеатоза.
Poria cocos Wolf (PCW) е ядлива медицинска гъба, която расте върху корените на борови дървета и се използва широко като билкова медицина в Китай, Япония и Корея [ 11 ]. PCW има забележителни биологични активности, включително антитуморни, противовъзпалителни, антиоксидантни, против стареене, антихепатични, антидиабетни и антихеморагични ефекти [ 11 , 12 , 13 ]. Основните биоактивни компоненти в PCW включват тритерпеноиди, мастни киселини, стероли и полизахариди [ 11 ]. Тези органични съединения, присъстващи в PCW, се използват в много традиционни китайски рецепти за лечение на гастрит, нефроза, оток, световъртеж, гадене, повръщане и хипергликемия [ 11 ]. Въпреки това, фармацевтичните ефекти на PCW срещу NAFLD не са докладвани досега.
Следователно, в това проучване, ние оценихме защитните ефекти на екстракта от PCW срещу чернодробна стеатоза и характеризирахме основните механизми в третирани с мастни киселини HepG2 клетки и мишки, хранени с диета с високо съдържание на мазнини (HFD). Тук, доколкото ни е известно, ние демонстрирахме за първи път, че PCW подобрява чернодробната стеатоза чрез регулиране на липидния метаболизъм, инхибиране на ER стреса и активиране на автофагията по AMPK-зависим начин, което допълнително подкрепя хипотезата, че PCW може да се използва като потенциално лечение на NAFLD.
2. Резултати
2.1. Цитотоксичност на смес от мастни киселини и PCW върху HepG2 клетки
За да се имитира чернодробна стеатоза in vitro, HepG2 клетките бяха изложени на свободна мастна киселина (FFA), съдържаща палмитат и олеат (съотношение 1:2). Първо, ние изследвахме цитотоксичността на смес от FFA и PCW върху HepG2 клетки. Както е показано вФигура 1A, B, клетъчната жизнеспособност не се повлиява от независимо третиране с 1 mmol/mL FFA и 80 μmol/mL PCW в HepG2 клетки. Въпреки това, комбинирано лечение с 1 mmol/mL FFA и 80 μmol/mL PCW показва цитотоксичност в HepG2 клетки (Фигура 1C), въпреки че комбинация от 1 mmol/mL FFA и 40 μmol/mL PCW показва по-малка цитотоксичност (Фигура 1° С). Следователно, съвместното третиране на HepG2 клетки с FFA и PCW се извършва при използване на 1 mmol/mL FFA и 40 μmol/mL PCW в следващите експерименти.
Фигура 1
Цитотоксичност на свободна мастна киселина (FFA) и Poria cocos Wolf (PCW) върху HepG2 клетки. ( A ) HepG2 клетки бяха третирани с различни концентрации на FFA (0, 0.25, 0.5, 1.0 или 2.0 mM) в продължение на 24 часа. ( B ) HepG2 клетки бяха третирани с различни концентрации на PCW (0, 20, 40, 80 или 160 μg/mL) в продължение на 24 часа. ( C ) HepG2 клетките бяха третирани съвместно с FFA (1 mM) и PCW (20, 40 или 80 μg/mL) в продължение на 24 часа. Клетъчната жизнеспособност се определя чрез 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиев бромид (МТТ) анализ. Данните представляват средна стойност ± SD от трикратни експерименти. p < 0,05 и * p < 0,01 спрямо нетретирана контрола. # p < 0.05 спрямо третирани с FFA клетки.
2.2. PCW инхибира индуцираното от FFA натрупване на TG в HepG2 клетки
Ние оценихме инхибиторния ефект на PCW екстрактите върху FFA-индуцираното вътреклетъчно натрупване на TG в HepG2 клетки. Оцветяването с маслено червено O (ORO) разкри, че в сравнение с нетретираните HepG2 (контролни) клетки, третираните с FFA клетки имат по-високи вътреклетъчни нива на TG. Въпреки това, предварителното третиране с PCW значително блокира индуцираното от FFA натрупване на TG (Фигура 2А). Ензимното измерване на вътреклетъчното съдържание на TG с помощта на търговски комплект разкрива, че PCW значително намалява съдържанието на TG, индуцирано от FFA в сравнение с това в HepG2 клетки, които не са третирани с PCW (Фигура 2Б). Тези резултати показват, че PCW екстрактите намаляват индуцираното от FFA вътреклетъчно натрупване на TG в HepG2 клетки.
Фигура 2
PCW инхибира индуцираното от FFA натрупване на триглицериди (TG) в HepG2 клетки. Клетките HepG2 бяха третирани с FFA (1 mM) и/или PCW (20 или 40 μg/mL) в продължение на 24 часа. ( A ) Оцветяването с маслено червено O (ORO) беше извършено и визуализирано под светлинен микроскоп (200 ×). Стълбчетата в графиките представляват вътреклетъчно липидно съдържание, определено чрез ORO оцветяване. ( B ) Измерване на вътреклетъчното количество TG. Данните представляват средна стойност ± SD от трикратни експерименти. p < 0,05 и ** p < 0,001 спрямо нетретирана контрола. # p < 0.05, ## p < 0.01 спрямо третирани с FFA клетки.
2.3. PCW активира AMPK пътя в HepG2 клетки, третирани с FFA
Активирането на AMPK инхибира чернодробната стеатоза чрез множество пътища [ 5 , 6 , 7 ]. За да изясним механизмите, лежащи в основата на превантивния ефект на PCW върху FFA-индуцираното натрупване на TG в HepG2 клетки, ние оценихме активирането на AMPK и неговото низходящо сигнализиране в HepG2 клетки. Както е показано вФигура 3A, третирането с екстракт от PCW индуцира фосфорилирането на AMPK при Thr172 и впоследствие фосфорилирането на ACC при Ser-79 - цел надолу по веригата на AMPK в HepG2 клетки - което показва, че PCW активира AMPK директно в HepG2 клетки. Освен това, ние оценихме благоприятните ефекти на PCW върху активирането на AMPK в третирани с FFA HepG2 клетки. Както е показано вФигура 3B, лечението с FFA значително намалява фосфорилирането на AMPK и ACC в HepG2 клетки. Въпреки това, предварителното третиране с PCW ефективно обръща фосфорилирането както на AMPK, така и на ACC. Взети заедно, тези резултати показват, че PCW активира AMPK пътя в HepG2 клетки, което може да играе важна роля в отслабването на FFA-индуцираното вътреклетъчно натрупване на TG в HepG2 клетки.
Фигура 3
PCW активира пътя на AMP-активирана протеин киназа (AMPK) в HepG2 клетки, третирани с FFA. ( A ) HepG2 клетките се инкубират с PCW (20 и 40 μg/mL) в продължение на 24 часа. Фосфорилирането на AMPK/ацетил-СоА карбоксилаза (АСС) се определя чрез Western blot. ( B ) HepG2 клетки бяха третирани с FFA (1 mM) и/или PCW (20 или 40 μg/mL) в продължение на 24 часа. Фосфорилирането на AMPK/ACC се определя чрез Western blot. Стълбовидните графики представляват денситометрични анализи на съотношенията на интензитета на лентата на p-AMPK/AMPK и p-ACC/ACC.
2.4. PCW инхибира експресията на гени за липогенеза и стимулира експресията на гени за окисляване на мастни киселини в HepG2 клетки, третирани с FFA
AMPK активирането фосфорилира SREBP1c – критичен транскрипционен фактор за стимулиране на гени за липогенеза, като по този начин инхибира транскрипционната активност на SREBP1c, което води до намалена липогенеза чрез регулиране надолу на SREBP1c-регулирани гени за липогенеза, включително FAS , SCD1 и ACC , както и SREBP1c [ 5 ] . Следователно, ние изследвахме фосфорилирането на SREBP1C и експресията на неговите целеви гени, участващи в липогенезата в третирани с FFA HepG2 клетки. Както е показано вФигура 4A, лечението с FFA доведе до минимално фосфорилиран SREBP - инхибиторна SREBP1c форма - но повиши протеиновите нива на SREBP1c (както прекурсор, така и зряла форма) и неговия целеви ген за липогенеза, FAS . Въпреки това, предварителната обработка с PCW значително обърна тези предизвикани от FFA ефекти (Фигура 4А). Освен това, qPCR анализ разкри, че лечението с FFA повишава нивата на mRNA на SREBP1s и неговите целеви гени за липогенеза, включително FAS , ACC1 и SCD1 ; въпреки това, предварителната обработка с PCW обърна FFA-медиираното повишаване на нивата на иРНК на тези липогенезни гени (Фигура 4Б). След това потвърдихме инхибиторните ефекти на PCW върху транскрипционната активност на SREBP1c в HepG2 клетки на базата на активностите на SREBP1c и FAS промотори, съдържащи SREBP-отговорния елемент. Както е показано вФигура 4C, лечението с FFA стимулира активността както на SREBP1c, така и на FAS промоторите, което беше обърнато чрез предварително третиране с PCW. Тези резултати предполагат, че PCW регулира надолу гените на липогенезата чрез инхибиране на SREBP1c.
Фигура 4
PCW инхибира стерол регулаторен елемент-свързващ протеин 1c (SREBP1c)-медиирана липогенеза в HepG2 клетки, третирани с FFA. Клетките HepG2 бяха третирани с FFA (1 mM) и/или PCW (20 и 40 μg/mL) в продължение на 24 часа. ( A ) Протеиновите нива на p-SREBP1c, SREBP1c и FAS бяха анализирани чрез Western blot. Денситометричният анализ на интензитета на лентата е показан на фигура S1 ( B ). Относителните нива на mRNA на SREBP1c и неговите целеви липогенезни гени бяха анализирани чрез qPCR. ( C ) HepG2 клетки бяха трансфектирани с SREBP1c-луцифераза (Luc) репортер или FAS-Luc репортер и инкубирани за 24 часа. Трансфектираните клетки бяха допълнително третирани с FFA (1 mM) и/или PCW (20 и 40 μg/mL) за допълнителни 24 часа. Luc активност беше определена. Данните представляват средно ± SD от трикратни експерименти. * p <0,05 спрямо нетретирана контрола. # p < 0.05 спрямо третирани с FFA клетки.
Активирането на AMPK стимулира окисляването на мастни киселини, което може да намали чернодробната стеатоза [ 5 ]. Следователно, ние оценихме експресията на гени, свързани с окислението на мастни киселини, в третирани с FFA HepG2 клетки. Както е показано вФигура 5A, лечението с FFA доведе до намаляване както на нивата на протеин, така и на мРНК на пероксизомен пролифератор-активиран рецептор-α ( PPARα ), ключов транскрипционен фактор на гена за окисляване на мастни киселини, но предварителната обработка с PCW обърна това намаление. Данните от qPCR също разкриха, че лечението с FFA води до намаляване на нивата на mRNA на PPARα целевите гени, включително карнитин палмитоилтрансфераза ( CPT1 ) и ацил-коензим А оксидаза ( ACO ) (Фигура 5B); въпреки това екстрактът от PCW обърна това понижение в нивата на иРНК. Взети заедно, тези резултати показват, че PCW инхибира липогенезата, но стимулира окисляването на мастни киселини, което може да доведе до намалено вътреклетъчно натрупване на TG в HepG2 клетки.
Фигура 5
PCW стимулира експресията на гени за окисляване на мастни киселини в HepG2 клетки, третирани с FFA. Клетките HepG2 бяха третирани с FFA (1 mM) и/или PCW (20 или 40 μg/mL) в продължение на 24 часа. ( A ) Протеиновите нива на PPARα бяха анализирани чрез Western blot. Стълбовидните графики представляват денситометричен анализ на съотношенията на интензитета на лентата на PPARα/актин. Относителните нива на mRNA на PPARα бяха анализирани чрез qPCR. ( B ) Относителните нива на mRNA на карнитин палмитоилтрансфераза ( CPT1 ) и ацил-коензим А оксидаза ( ACO ) бяха анализирани чрез qPCR. Данните представляват средно ± SD от трикратни експерименти. * p <0,05 спрямо нетретирана контрола. # p < 0.05 спрямо третирани с FFA клетки.
2.5. PCW облекчава ER стреса в HepG2 клетки, третирани с FFA
Активирането на AMPK регулира негативно ER стреса, който индуцира чернодробна стеатоза чрез повишена липогенеза и намалена секреция на аполипопротеин [ 6 ]. Ние изследвахме дали PCW-медиираното отслабване на натрупването на TG е свързано с облекчаване на ER стреса. За тази цел, ние изследвахме ER стрес маркери, включително GRP78, CHOP, XBP1c и p-PERK в третирани с FFA HepG2 клетки. Western blot разкри, че лечението с FFA индуцира GRP78, CHOP, XBP1c и p-PERK и повишава техните протеинови нива. PCW обаче обръща индукцията на тези протеини, което предполага, че PCW е способен да облекчи индуцирания от FFA ER стрес (Фигура 6). Взети заедно, тези резултати предполагат, че облекчаването на ER стреса може да играе роля в защитата на PCW срещу чернодробна стеатоза.
Фигура 6
PCW облекчава стреса на ендоплазмения ретикулум (ER) в HepG2 клетки, третирани с FFA. Клетките HepG2 бяха третирани с FFA (1 mM) и/или PCW (20 или 40 μg/mL) в продължение на 24 часа. Протеиновите нива на ER стрес маркери бяха анализирани чрез Western blot. Стълбовидните графики представляват денситометричен анализ на съотношенията на интензитета на лентата на GRP78/актин, CHOP/актин, XPB1c/актин и p-PERK/PERK.
2.6. PCW активира аутофагията в HepG2 клетки, третирани с FFA
Активирането на AMPK индуцира аутофагия, която играе важна роля в превенцията на чернодробна стеатоза [ 9 ]. За да разберем ефекта на PCW в индуцирането на аутофагия, ние изследвахме експресията на маркери за аутофагия в третирани с FFA HepG2 клетки. Както е показано вФигура 7A, лечението с FFA намалява нивата на протеини, свързани с автофагозома, включително LC3A/B, намотка, миозин-подобен BCL2-взаимодействащ протеин (Beclin) 1 и протеин, свързан с автофагия (ATG) 3, 7 и 16, в HepG2 клетки. Въпреки това, предварителното третиране с PCW обърна тези ефекти (Фигура 7А). Автофагията се регулира от пътя mTOR/p70S6K, който инхибира автофагията чрез инхибиране на образуването на автофагозома [ 10 ]. Затова изследвахме дали PCW-медиираното активиране на аутофагията е свързано с mTOR/p70S6K в HepG2 клетки. Както е показано вФигура 7B (вляво), лечението с FFA повишава нивата на фосфорилиран mTOR и p70S6K, компонентите надолу по веригата на mTOR сигнализирането; обаче, предварителната обработка с PCW обърна тези ефекти. Освен това, лечението с PCW намалява директно фосфорилирането на mTOR и p70S6K (Фигура 7B, вдясно), което показва, че PCW активира аутофагията чрез инхибиране на mTOR/p70S6K сигнализиране. Тези резултати предполагат, че индуцираното от PCW активиране на аутофагия може да играе важна роля в отслабването на чернодробната стеатоза от PCW.
Фигура 7
PCW активира автофагията в HepG2 клетки, третирани с FFA. Клетките HepG2 бяха третирани с FFA (1 mM) и/или PCW (20 или 40 μg/mL) в продължение на 24 часа. ( A ) Протеиновите нива на маркерите за автофагия бяха анализирани чрез Western blot. ( B ) Фосфорилирането на p-mTOR/p-P79S6K се определя чрез Western blot. Денситометричният анализ на интензитета на лентата е показан на фигура S2 .
2.7. Предварително третиране със съединение С, AMPK инхибитор, обръща PCW-медиираните благоприятни ефекти върху чернодробна стеатоза в HepG2 клетки, третирани с FFA
За да потвърдим дали медиираните от PCW благоприятни ефекти върху чернодробната стеатоза са свързани с активирането на AMPK, ние оценихме активирането на AMPK и вътреклетъчното натрупване на TG в третирани с FFA HepG2 клетки, третирани предварително със съединение С, инхибитор на AMPK. Както е показано вФигура 8A, лечението с PCW обърна медиираното от FFA намаляване на нивата на p-AMPK и p-ACC; въпреки това, предварителното третиране със съединение С инхибира PCW-индуцираното фосфорилиране на AMPK и ACC. (Фигура 8А). Измерването на вътреклетъчното съдържание на TG разкрива, че PCW предотвратява индуцираното от FFA натрупване на TG, докато предварителното третиране със съединение C отменя този превантивен ефект (Фигура 8Б). Това предполага, че активирането на AMPK е свързано с PCW-медиирано отслабване на чернодробната стеатоза. Освен това, за да докажем дали защитните механизми на PCW върху чернодробната стеатоза са свързани с активиране на AMPK, ние определихме експресията на гени на липидния метаболизъм, ER стрес маркери и протеини, свързани с образуването на автофагозома в HepG2 клетки, предварително третирани със съединение С. В съответствие с предишното резултати, PCW обърна FFA-медиираното повишаване на нивата на иРНК на липогенезните гени (Фигура 9A) и намаляване на нивата на иРНК на гените за окисляване на мастни киселини (Фигура 9Б). Предварителното третиране със съединение С блокира тези PCW-медиирани ефекти и също инхибира PCW-медиираните благоприятни ефекти върху ER стрес маркерите (Фигура 9C) и протеин, свързан с образуването на автофагозома (Фигура 9D) в третирани с FFA HepG2 клетки. Взети заедно, тези резултати показват, че защитните механизми на PCW при чернодробна стеатоза се медиират чрез AMPK активиране.
Фигура 8
Инхибирането на AMPK предотвратява медиираното от PCW намаляване на вътреклетъчното натрупване на TG в HepG2 клетки, третирани с FFA. Клетките HepG2 бяха предварително третирани със съединение С (Комп С, 10 μM) в продължение на 3 часа и след това третирани с FFA (1 mM) и PCW (20 или 40 μg/mL) в продължение на 24 часа. ( A ) Фосфорилирането на AMPK/ACC се определя чрез Western blot. Денситометричният анализ на интензитета на лентата е показан на фигура S3 . ( B ) Измерване на вътреклетъчния TG. Данните представляват средно ± SD от трикратни експерименти. * p <0,05 спрямо нетретирана контрола. # p < 0.05 спрямо третирани с FFA клетки. $ p < 0,05 спрямо клетки, третирани с FFA и PCW.
Фигура 9
Инхибирането на AMPK, използвайки съединение С, обръща PCW-медиираните ефекти върху експресията на липогенезата и гените за окисление на мастни киселини, ER стрес и автофагия в HepG2 клетки, третирани с FFA. Клетките HepG2 бяха предварително третирани със съединение С (Комп С, 10 μM) в продължение на 3 часа и след това третирани с FFA (1 mM) и PCW (20 или 40 μg/mL) в продължение на 24 часа. ( A ) Относителни нива на mRNA на SREBP1C , FAS , SCD1 и ACC1 , анализирани чрез qPCR. ( B ) Относителните нива на mRNA на PPAR α и CPT1 бяха анализирани чрез qPCR. ( C ) Протеиновите нива на ER стрес маркери бяха анализирани чрез Western blot. Денситометричният анализ на интензитета на лентата е показан на фигура S4 . ( D ) Нивата на протеини на протеини на автофагия бяха анализирани чрез Western blot. Денситометричният анализ на интензитета на лентата е показан на фигура S5 . Данните представляват средно ± SD от трикратни експерименти. * p <0,05 спрямо нетретирана контрола. # p < 0.05 спрямо третирани с FFA клетки. $ p < 0,05 спрямо клетки, третирани с FFA и PCW.
2.8. PCW предпазва от HFD-индуцирана чернодробна стеатоза in vivo
Ние оценихме in vivo ефектите на PCW върху чернодробната стеатоза при индуцирани от HFD затлъстели мишки. Хистологичното изследване разкрива, че храненето с HFD е довело до развитие на бяло оцветен мастен черен дроб; въпреки това приложението на PCW доведе до поддържане на относително здрав черен дроб (Фигура 10А). Храненето с HFD доведе до повишено тегло на черния дроб и по-високи съотношения черен дроб: телесно тегло, докато приложението на PCW значително блокира това увеличение при хранени с HFD затлъстели мишки (Фигура 10Б). Измерването на чернодробните нива на триглицериди разкри, че приложението на PCW води до намаляване на нивата на триглицериди (Фигура 10° С). Взети заедно, тези резултати показват, че PCW подобрява мастния черен дроб при индуцирани от HFD затлъстели мишки. И накрая, за да потвърдим дали медиираното от PCW подобрение на чернодробната стеатоза зависи от AMPK пътя, ние оценихме AMPK фосфорилирането в черния дроб на затлъстели мишки, хранени с HFD. Както е показано вФигура 10D, HFD намалява фосфорилирането на AMPK и ACC в черния дроб, което се обръща от приложението на PCW.
Фигура 10
PCW подобрява индуцираната от диета с високо съдържание на мазнини (HFD) чернодробна стеатоза чрез AMPK активиране. C57BL6 мишки бяха хранени с HFD в продължение на 6 седмици и след това PCW беше приложен перорално за още 6 седмици. ( A ) Представителни изображения на чернодробната морфология. Мащабната лента е 1 cm. ( B ) Тегло на черния дроб и съотношение на черния дроб към телесното тегло. Данните представляват средно ± SD от 5 мишки. p <0,05 спрямо ND (нормална диета) мишки. # p < 0.05 спрямо HFD мишки. ( C ) Измерване на нивата на чернодробни TG. Данните представляват средно ± SD от 5 мишки. p <0.05 спрямо ND мишки. # p < 0.05 спрямо HFD мишки. ( D ) Фосфорилирането на AMPK/ACC се определя в чернодробни лизати чрез Western blot.
2.9. Poricoic Acid, Pachymic Acid и Ergosterol са отговорни за PCW-медиираното отслабване на чернодробната стеатоза
Основните биоактивни компоненти в PCW включват полизахариди, тритерпеноиди, мастни киселини, стероли и ензими [ 11 ]. За да идентифицираме кои съединения са отговорни за PCW-медиираното облекчаване на чернодробната стеатоза, ние избрахме три основни химични компонента на PCW-порикова киселина, пахиминова киселина и ергостерол и оценихме техните ефекти върху чернодробната стеатоза в HepG2 клетки, третирани с FFA. За да определим концентрацията на всяко съединение, използвано в изследването, първо изследвахме цитотоксичността на всяко съединение върху HepG2 клетки. Както е показано вФигура 11A, клетъчната жизнеспособност не се повлиява съответно от до 12,5 μM порикоидна киселина, 1,25 μM пахиминова киселина и 1,25 μM ергостерол. По този начин благоприятните ефекти на тези три съединения върху чернодробната стеатоза са изследвани при 6,25 μM и 12,5 μM за порикоидна киселина и 0,63 μM и 1,25 μM както за пахиминова киселина, така и за ергостерол, в HepG2 клетки, третирани с FFA. Както е показано вФигура 11B, Western blot анализ разкри, че и трите съединения директно индуцират фосфорилирането на AMPK и ACC в HepG2 клетки. След това оценихме инхибиторните ефекти на тези три съединения върху вътреклетъчното натрупване на TG в HepG2 клетки, третирани с FFA. Както е показано вФигура 11C, всичките три съединения значително намаляват индуцираното от FFA вътреклетъчно натрупване на TG в съответствие с повишаването на AMPK фосфорилирането. Тези резултати показват, че пориковата киселина, пахимовата киселина и ергостеролът са отговорни за PCW-медиираното отслабване на чернодробната стеатоза.
Фигура 11
Порикоинова киселина, пахиминова киселина и ергостерол са отговорни за PCW-медиираното отслабване на чернодробната стеатоза. ( A ) HepG2 клетките бяха третирани с различни концентрации на пориконова киселина (Po) (0, 6.25, 12.5, 25, 50 или 100 μM), пахиминова киселина (Pa) (0, 0.63, 1.25, 2.5, 5 или 10 μM) или ергостерол (Er) (0, 0,63, 1,25, 2,5, 5 или 10 μM) за 24 часа. Клетъчната жизнеспособност се определя чрез МТТ анализ. ( B ) HepG2 клетки бяха третирани с Po (6 или 12 μM), Pa (0.6 или 1.2 μM) или Er (0.6 или 1.2 μM) за 24 часа. Фосфорилирането на AMPK/ACC се определя чрез Western blot. Денситометричните анализи на съотношенията на интензитета на лентата за p-AMPK/AMPK и p-ACC/ACC са показани на фигура S6 ( допълнителни материали ). ( C ) Измерват се вътреклетъчни количества TG. Данните представляват средно ± SD от трикратни експерименти. p < 0,05, * p < 0,01 и *** p < 0,001 спрямо нетретирана контрола. # p < 0.05 спрямо третирани с FFA клетки.
3. Дискусия
Чернодробната стеатоза е първата стъпка в развитието на NAFLD; следователно разработването на съединения, които могат да облекчат чернодробната стеатоза, може потенциално да помогне при лечението на NAFLD. PCW, гъба с биоактивни съединения, е широко използвана като билкова медицина в Азия поради разнообразните си фармакологични ефекти, включително противоракови и противовъзпалителни свойства [ 11 ]. Въпреки това, неговите ефекти срещу чернодробна стеатоза не са докладвани. Следователно ние изследвахме дали екстрактите от PCW проявяват някаква терапевтична активност срещу чернодробна стеатоза в HepG2 клетки, третирани с FFA и при HFD мишки със затлъстяване. Нашите резултати показват, че PCW значително намалява натрупването на чернодробни TG както в третирани с FFA HepG2 клетки, така и в HFD затлъстели мишки, което предполага, че PCW упражнява защитна активност срещу чернодробна стеатоза. Освен това, ние наблюдавахме, че PCW повишава фосфорилирането на AMPK, ACC и SREBP1c в HepG2 клетки, третирани с FFA и инхибира de novo липогенезата. PCW намалява ER стреса, но стимулира окислението на мастни киселини и аутофагията в HepG2 клетки, третирани с FFA. Въпреки това, инхибирането на AMPK значително обръща тези благоприятни ефекти, което предполага, че PCW подобрява чернодробната стеатоза чрез активиране на AMPK.
Активирането на AMPK инхибира чернодробната стеатоза чрез множество механизми [ 5 , 6 , 7 ]. Първо, AMPK инхибира липогенезата чрез инактивиране на ACC и SREBP1c. ACC е ензим за липогенеза и регулира синтеза на малонил-КоА. AMPK инактивира ACC чрез фосфорилиране. Инактивирането на ACC чрез фосфорилиране води до понижени нива на малонил-CoA, като по този начин инхибира чернодробната липогенеза и стимулира окислението на мастни киселини. Нашите открития показват, че PE стимулира фосфорилирането на AMPK и ACC в HepG2 клетки и че PE инхибира липогенезата и причинява намалено натрупване на TG чрез AMPK-лекарствено фосфорилиране на ACC. Освен това, активирането на AMPK инхибира транскрипционната активност на SREBP1c чрез фосфорилирането на SREBP1c. Фосфорилирането на SREBP1c при Ser372 инхибира протеолитичната обработка и транслокационното активиране на SREBP-1 и впоследствие потиска експресията на SREBP1c целеви липогенезни гени, включително FAS , ACC и SCD1 , както и тази на SREBP1c . Нашите данни разкриха, че PCW засилва фосфорилирането на SREBP-1c (Ser372) едновременно с повишено фосфорилиране на AMPK и намалена експресия на гени за липогенеза, включително SREBP1c, FAS, ACC и SCD1 в HepG2 клетки, което предполага, че екстрактът от PCW също инхибира липогенезата чрез фосфорилиране и инактивиране на SREBP1c. Въпреки това, лечението с AMPK инхибитор значително обърна PCW-медиираната низходяща регулация на липогенезните гени, демонстрирайки, че благоприятният ефект на PCW върху липогенезата е свързан с AMPK активиране.
Второ, AMPK стимулира окисляването на мастни киселини чрез регулиране нагоре на PPARα-медиирани гени за окисление на мастни киселини, включително CPT1 и ACO [ 5 ]. Нашите резултати разкриха, че лечението с FFA понижава експресията на PPARα и неговите целеви гени за окисляване на мастни киселини в HepG2, докато предварителното третиране с PCW обърна тези ефекти. Инхибирането на AMPK с помощта на AMPK инхибитор значително блокира индуцираното от PCW регулиране на гените за окисление на мастни киселини, което показва, че стимулираното от PCW окисление на мастни киселини зависи от активирането на AMPK, което може също да допринесе за действие срещу чернодробна стеатоза.
Трето, активирането на AMPK инхибира индукцията на ER стрес, което води до отслабване на чернодробната стеатоза [ 6 ]. Дългосрочното активиране или неразрешеният ER стрес води до натрупване на чернодробни липиди чрез повишена липогенеза чрез SREBP1c активиране и намален износ на вътреклетъчен TG навън чрез VLDL [ 8 ]. Следователно фармакологичните модулатори на ER стреса биха могли да бъдат терапевтични кандидати за NAFLD [ 8 ]. В това проучване ние изследвахме дали PCW инхибира FFA-индуцирания ER стрес в HepG2 клетки. Ние наблюдавахме, че PCW значително предотвратява индуцирането на ER стрес в HepG2 клетки, третирани с FFA. В съответствие с отслабването на ER стреса, нашите резултати показват, че PCW инхибира липогенезата и представлява механизъм, чрез който ER индуцира натрупване на липиди. Инхибирането на PCW-медиираното отслабване на ER стреса беше значително блокирано от AMPK инхибирането, което предполага, че PCW-медиираното отслабване на ER зависи от AMPK активирането. Активираният AMPK упражнява защитен ефект върху ER стреса чрез няколко пътя [ 6 , 14 , 15 ]. Един от тях е медииран чрез инхибиране на mTOR-зависимото сигнализиране [ 6 ]. Излишните хранителни вещества активират mTORC1 сигнализиране, което индуцира ER стрес и експресията на SREBP1c и гени за липогенеза, което води до последващо натрупване на TG в черния дроб. По този начин, инхибирането на mTORC1 чрез AMPK активиране предотвратява излишното индуцирано от хранителни вещества натрупване на чернодробни липиди чрез потискане на ER стрес и SREBP1c-зависима липогенеза. Нашите резултати разкриха, че PCW намалява индуцираното от FFA фосфорилиране на mTOR и P70S6k и експресията на SREBP1c и неговите целеви липогенезни гени, в съответствие с повишеното фосфорилиране на AMPK. Това предполага, че PCW инхибира ER стреса чрез инхибиране на mTORC1-зависимата липогенеза чрез AMPK активиране. Друг механизъм, участващ в инхибирането на ER стрес от AMPK, е чрез експресията на кислород-регулиран протеин (ORP150), ER-асоцииран шаперон и саркоендоплазмен ретикулум Ca 2+ -ATPase 2b (SERCA2b), който инхибира ER стреса [ 14 , 15 ]. ORP150 играе защитна роля при ER стрес чрез увеличаване на капацитета на ER за сгъване и разграждане на протеини, като впоследствие облекчава ER стреса [ 16 ]. Активирането на AMPK увеличава капацитета на ER стрес за сгъване и разграждане на протеин чрез свръхекспресия на ORP150, което води до инхибиране на ER стрес. Освен това, SERCA е ER мембранен протеин, който играе роля в усвояването на Ca 2+ от цитозола в ER лумена. Дисфункционалната SERCA води до освобождаване на Ca 2+ от лумена на ER и води до промяна на ER хомеостазата и впоследствие на ER стрес [ 17].]. Повишената регулация на SERCA подобрява променения калциев баланс по време на ER стрес, което води до отслабване на ER стреса. За да се характеризира подробният механизъм, чрез който PCW инхибира ER стреса, е необходимо допълнително проучване, включващо ефектите на PCW върху експресията на ORP150 и SERCA2b .
Четвърто, активирането на AMPK упражнява положителен ефект върху автофагията [ 7 ]. Автофагията играе важна роля във вътреклетъчното разграждане на липидите чрез мобилизиране на липидните капчици след образуването на автофагозома към лизозомата за разграждане на липидните капчици (LD) чрез киселинна хидролаза (липофагия) [ 9 ]. Инхибирането на медиираното от автофагия разграждане на вътреклетъчния TG играе съществена роля в развитието на чернодробна стеатоза. Чернодробната липофагия е значително намалена при затлъстели и NAFLD моделни мишки [ 18 ]. Следователно фармакологичното активиране на липофагията може да бъде потенциална терапевтична цел срещу чернодробна стеатоза. Нашето проучване разкри, че PCW обръща FFA-медиираното инхибиране на протеини, свързани с образуването на автофагозоми, включително LC3A/B, Beclin, ATG 3, 3, 16, в HepG2 клетки, третирани с FFA, което показва, че PCW също проявява ефекти срещу чернодробна стеатоза чрез активиране на липофагия. AMPK активира липофагията чрез инхибиране на mTORC1 сигнализиране, което инхибира автофагията чрез потискане на образуването на автофагозома. Активирането на AMPK намалява фосфорилирането на mTOR и p70S6K, надолу по веригата на mTOR, което води до ефективно образуване на автофагозома и биогенеза на лизозома. Нашите резултати показват, че PCW намалява индуцираното от FFA фосфорилиране на mTOR и p70S6K едновременно повишава фосфорилирането на AMPK; обаче, лечението със съединение С значително блокира тези ефекти, което предполага, че PCW активира аутофагията чрез инхибиране на mTOR чрез AMPK, което може също да допринесе за отслабване на чернодробната стеатоза. Автофагията и ER стресът се регулират взаимно [ 19 ]. Въз основа на нашите резултати, PCW-медиираното потискане на ER стрес може да допринесе за активирането на аутофагията от PCW. Обратно, активирането на аутофагията играе роля в PCW-медиираното инхибиране на ER стреса. Взети заедно, нашите резултати показват, че активирането на AMPK/mTOR-зависим път на автофагия играе важна роля в PCW-медиирана защита на чернодробна стеатоза.
Защитните ефекти на PCW срещу чернодробна стеатоза при HFD-индуцирани затлъстели мишки бяха допълнително потвърдени in vivo. Индуцираната от HFD чернодробна стеатоза, характеризираща се с повишено натрупване на чернодробни липиди, е ефективно блокирана от приложението на PCW, както се вижда от хистологичното изследване и измерванията на чернодробните TG. PCW също възстановява HFD-медиираната редукция на AMPK фосфорилирането. Тези резултати потвърждават, че PCW проявява ефекти срещу чернодробна стеатоза чрез AMPK активиране in vivo.
За да определим кои компоненти в PCW са отговорни за PCW-медиираното подобрение на чернодробната стеатоза, ние изследвахме благоприятните ефекти на три основни химични компонента, присъстващи в PCW-порикова киселина, пахиминова киселина и ергостерол в HepG2 клетки, третирани с FFA. И трите съединения показват ефекти срещу чернодробна стеатоза, съответстващи на активирането на AMPK в HepG2 клетки, третирани с FFA. Необходими са по-нататъшни изследвания, за да се установят анти-чернодробните стеатозни ефекти in vivo и да се характеризират основните механизми.
В заключение, PCW упражнява защитен ефект срещу чернодробна стеатоза в HepG2 клетки, третирани с FFA и HFD затлъстели мишки чрез регулиране на липидния метаболизъм, инхибиране на ER стрес и активиране на аутофагия по AMPK-зависим начин. Екстрактът от PCW има терапевтичен потенциал за лечение на NAFLD. Необходими са допълнителни проучвания, за да се проверят благоприятните ефекти на PCW, особено за намаляване на риска от други метаболитни нарушения.
4. Материали и методи
4.1. Реактиви
Палмитат, олеат и съединение С са закупени от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). Антитела срещу AMPKα, фосфо-AMPKα (Thr172), SREBP1c, FAS, PPARα, GRP78, CHOP, XBP1C, p-PERK (Thr981), PERK и актин бяха закупени от Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, САЩ). Бяха закупени антитела срещу ACC, фосфо-ACC (Ser79), фосфор-SREBP1c (Ser372), LC3A/B, Beclin1, ATG3, ATG7, ATG16L1, фосфо-mTOR (Ser2448), mTOR, фосфо-P70S6K (Thr389) и P70S6K от Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). SREBP-луцифераза (Luc) и FAS-Luc репортери бяха закупени от Addgene (Кеймбридж, Масачузетс, САЩ).
4.2. Приготвяне на PCW екстракт
Гъбата е идентифицирана от д-р Юн Тай Ким на базата на „Илюстровано ръководство за клинични лечебни билки“ [ 20 ] и образец от ваучер (#NP-1090) е депозиран в изследователската група за функционални хранителни материали, Корейски институт за изследване на храните . Изсушен PCW (900 g) се екстрахира с 95% етанол (9000 mL) в продължение на 6 часа при 80 °C. Екстрактът се филтрира през мембранен филтър (0.45 цт; Millipore, Billerica, MA, USA). След отстраняване на разтворителя чрез ротационно изпаряване, останалият екстракт се изсушава чрез замразяване, като се получават около 1.25% от изсушеното тегло ( w / w ).
4.3. Клетъчна култура
HepG2 клетки, закупени от Американската колекция от типови култури (ATCC, CL-173TM; Манасас, Вирджиния, САЩ) се поддържат в модифицирана среда на Ийгъл на Dulbecco (DMEM; HyClone, Логан, Юта, САЩ), съдържаща 10% фетален телешки серум (FCS; HyClone), 50 единици/mL пеницилин и 50 mg/mL стрептомицин при 37 °C във влажна атмосфера с 5% CO2. HepG2 клетките бяха третирани със смес от FFA (палмитат и олеат, съотношение 1:2) в присъствието или отсъствието на PCW в продължение на 24 часа за измерване на протеинови нива или натрупване на TG.
4.4. Тест за цитотоксичност
Цитотоксичността на FFA и/или PCW се измерва с помощта на 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиев бромид (MTT) анализ. Накратко, клетките се посяват в 96-ямкови плаки при плътност от 1 × 104 клетки на ямка и се третират с различни концентрации на FFA (0, 0.25, 0.5, 1 и 2 mM) и/или PCW (0, 20, 40 , 80 и 160 μg/mL). След инкубиране в продължение на 24 часа се добавя МТТ (1 mg/mL) и плаката се инкубира допълнително в продължение на 4 часа при 37 °С. Абсорбцията се измерва при 570 nm с помощта на четец на микроплаки.
4.5. ORO оцветяване
HepG2 клетките се промиват два пъти с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) и се фиксират с 10% формалдехид за 30 минути при стайна температура. След фиксиране, клетките се промиват отново с PBS и се оцветяват с ORO работен разтвор (1.5 mg/mL ORO/60% изопропанол) и се инкубират за 30 минути при стайна температура. След това клетките бяха изплакнати със 75% етанол за отстраняване на несвързаното багрило и впоследствие бяха промити с PBS преди да бъдат изобразени с помощта на светлинен микроскоп. Багрилото се разтваря с помощта на 100% изопропанол и абсорбцията се измерва при 510 nm с помощта на четец на микроплаки.
4.6. TG измерване
HepG2 клетъчни суспензии и миши чернодробни лизати се смесват със 750 μL хлороформ/метанол/H2O (8:4:3, v / v / v ) за екстрахиране на TGs. Клетъчните суспензии или чернодробните лизати се инкубират при стайна температура в продължение на 1 час и се центрофугират при 800 х g в продължение на 10 минути. Полученият долен слой (органична фаза) се суши за една нощ и се разтваря в етанол преди определяне на концентрацията на TG с помощта на комплект за ензимна реакция (Asan Pharmaceutical, Сеул, Република Корея) и стойностите се нормализират до съдържанието на протеин.
4.7. Western Blot
HepG2 клетките и чернодробната тъкан се лизират в ледено студен лизисен буфер, съдържащ коктейл от протеазен инхибитор и 1 тМ фенилметансулфонил флуорид за 30 минути и се подлагат на центрофугиране при 10 000 × g за 30 минути при 4 ° С. Протеините (50 μg) бяха подложени на електрофореза с натриев додецилсулфат полиакриламиден гел и бяха прехвърлени върху мембрани от поливинилиден дифлуорид (Millipore, Billerica, MA, USA). Мембраните бяха блокирани с помощта на 5% обезмаслено обезмаслено мляко за 30 минути при стайна температура и бяха изследвани с първични антитела. След промиване с Tween 20/Tris-буфериран физиологичен разтвор (T-TBS), мембраните се инкубират с вторично антитяло, конюгирано с пероксидаза от хрян (1:1000) в продължение на 1 час при стайна температура. След това мембраните се промиват три пъти с T-TBS и протеините се откриват с помощта на комплект за откриване на western blot с подобрена хемилуминесценция (ECL) (Amersham, Uppsala, Швеция).
4.8. qPCR
Общата РНК се изолира от HepG2 клетки с помощта на TRIzol® ( Ambion Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, САЩ). cDNA се генерира от 1 μg обща РНК, като се използва системата за обратна транскрипция GoScript™ (Promega, САЩ) съгласно протокола на производителя. PCR амплификацията се извършва с помощта на SYBR Green предварително смесена Taq реакционна смес и ген-специфични праймери. Праймерните последователности, използвани в това изследване, са: SREBP1c 5'-CGGAGCCATGGATTGCACT-3' (сенс) и 5'-TAGGCCAGGGAAGTCACTG-3' (антисенс); FAS 5'-TCGTGGGCTACAGCATGGT-3' (сенс) и 5'-GCCCTCTGAAGTCGAAGAAGAA-3' (антисенс); SCD1 5'-CCAGTCAACTCCTCGCACTT (сенс) и 5'-AGCCAGGTTTGTAGTACCTCC-3' (антисенс); ACC 5'-CTGTAGAAACCCGGACAGTAGTAGAAC-3' (сенс) и 5'-GGTCAGCATACATCTCCATGTG-3' (антисенс); PPARα 5'-GGACAGCAAATCTTGAAGCAGC-3' (сенс) и 5'-CTCTGATCCCTCTAGCACCTT-3' (антисенс); CPT1 5'-TTTCCTTGCTGAGGTGCTCT-3' (сенс) и 5'-TCTCGCCTGCAATCATGTAG-3' (антисенс); и ACO 5'-CAGGAA AGTTGGTGTGTGGC-3' (сенс) и 5'-AATCTGGCTGCACGGAGTTT-3' (антисенс).
4.9. Луциферазен анализ
Клетките HepG2 бяха временно трансфектирани с репортерен плазмид SREBP1c–Luc или репортерен плазмид FAS–Luc и инкубирани за 24 часа. След това клетките се третират с FFA (1 mM) и/или PCW (20 или 40 μg/mL) в продължение на 24 часа. Луциферазната активност се измерва с помощта на система за анализ Luc (Promega, Madison, WI, USA).
4.10. Експерименти с животни
C57BL/6 мишки (мъжки, на възраст 6 седмици) бяха получени от Jung-Ang Lab Animal, Inc. (Сеул, Корея). Животните бяха настанени при условия на оптимална температура (21–23 °C) и влажност (40–60%), с 12-часов цикъл светлина/тъмнина и им беше даден свободен достъп до храна и вода. Мишките бяха хранени с нормална диета (ND) или HFD в продължение на 6 седмици. След това мишките, хранени с HFD, бяха разделени на случаен принцип в следните три групи ( n = 8 на група): HFD (третирана с дестилирана вода) група, HFD + ниска доза PCW (100 mg/kg телесно тегло) група и HFD + висока доза PCW (300 mg/kg телесно тегло) група. Използваната експериментална диета беше TD.06414, базирана на HFD, съдържаща 60% kcal мазнини. Контролната диета съдържа 10% kcal мазнини. PCW се прилага перорално всеки ден в продължение на 6 седмици. Протоколът за експерименти с животни, използван в това проучване, беше прегледан и одобрен от Комитета за институционална грижа и използване на животните на Националния университет Пусан в съответствие с установените етични и научни процедури за грижа (Одобрение № PNU-2018-1832, 12/01/2018).
4.11. Статистически анализ
Всички данни са представени като средни ± SD стойности. Данните бяха анализирани с помощта на еднопосочна ANOVA и разликите между средните стойности бяха определени с помощта на пост-хок тест на Tukey-Kramer. Стойностите се считат за статистически значими при p <0,05.
ACC | Ацетил-КоА карбоксилаза |
ACO | Ацил-коензим А оксидаза |
ЧОП | C/EBP хомоложен протеин |
CPT1 | Карнитин палмитоилтрансфераза-1 |
GRP78 | Глюкозо-регулиран протеин 78 |
mTOR | Цел на рапамицин при бозайници |
ORO | Маслено червено O |
p-PERK | Фосфорилирана протеин киназа-подобна ER киназа |
qPCR | Количествена полимеразна верижна реакция |
SCD1 | Стеароил-КоА десатураза-1 |
SERCA2b | Саркоендоплазмен ретикулум Ca 2+ -ATPase 2b |
TG | Триглицерид |
VLDL | Липопротеини с много ниска плътност |
Ако сте се възползвали от информацията и полезните съвети, които предоставяме в нашия блог, ще се радваме, ако ни последвате и споделите статията с приятелите си. Можете също така да споделите вашето мнение или личен опит в коментарите!
Източници:
1. Fan J.G., Farrell G.C. Epidemiology of non-alcoholic fatty liver disease in China. J. Hepatol. 2009;50:204–210. doi: 10.1016/j.jhep.2008.10.010. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
2. Farrell G.C., Larter C.Z. Nonalcoholic fatty liver disease: From steatosis to cirrhosis. Hepatology. 2006;43:S99–S112. doi: 10.1002/hep.20973. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
3. Bagherniya M., Nobili V., Blesso C.N., Sahebkar A. Medicinal plants and bioactive natural compounds in the treatment of non-alcoholic fatty liver disease: A clinical review. Pharmacol. Res. 2018;130:213–240. doi: 10.1016/j.phrs.2017.12.020. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
4. Garcia D., Shaw R.J. AMPK: Mechanisms of cellular energy sensing and restoration of metabolic balance. Mol. Cell. 2017;66:789–799. doi: 10.1016/j.molcel.2017.05.032. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
5. Day E.A., Ford R.J., Steinberg G.R. AMPK as a Therapeutic Target for Treating Metabolic Diseases. Trends Endocrinol. Metab. 2017;28:545–560. doi: 10.1016/j.tem.2017.05.004. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
6. Li H., Min Q., Ouyang C., Lee J., He C., Zou M.H., Xie Z. AMPK activation prevents excess nutrient-induced hepatic lipid accumulation by inhibiting mTORC1 signaling and endoplasmic reticulum stress response. Biochim. Biophys. Acta. 2014;1842:1844–1854. doi: 10.1016/j.bbadis.2014.07.002. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
7. Tamargo-Gómez I., Mariño G. AMPK: Regulation of Metabolic Dynamics in the Context of Autophagy. Int. J. Mol. Sci. 2018;19:3812. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
8. Lebeaupin C., Vallée D., Hazari Y., Hetz C., Chevet E., Bailly-Maitre B.J. Endoplasmic reticulum stress signalling and the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease. Hepatology. 2018;69:927–947. doi: 10.1016/j.jhep.2018.06.008. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
9. Schulze R.J., Sathyanarayan A., Mashek D.G. Breaking fat: The regulation and mechanisms of lipophagy. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Biol. Lipids. 2017;1862:1178–1187. doi: 10.1016/j.bbalip.2017.06.008. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
10. Zoncu R., Efeyan A., Sabatini D.M. mTOR: From growth signal integration to cancer, diabetes and ageing. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2011;12:21–35. doi: 10.1038/nrm3025. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
11. Sun Y. Biological activities and potential health benefits of polysaccharides from Poria cocos and their derivatives. Int. J. Biol. Macromol. 2014;68:131–134. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2014.04.010. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
12. Dai B., Wu Q., Zeng C., Zhang J., Cao L., Xiao Z., Yang M. The effect of Liuwei Dihuang decoction on PI3K/Akt signaling pathway in liver of type 2 diabetes mellitus (T2DM) rats with insulin resistance. J. Ethnopharmacol. 2006;192:382–389. doi: 10.1016/j.jep.2016.07.024. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
13. Jeong J.W., Lee H.H., Han M.H., Kim G.Y., Hong S.H., Park C., Choi Y.H. Ethanol extract of Poria cocos reduces the production of inflammatory mediators by suppressing the NF-kappaB signaling pathway in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages. BMC Complement. Altern. Med. 2014:1505–1511. doi: 10.1186/1472-6882-14-101. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
14. Jung T.W., Kyung E.J., Kim H.C., Shin Y.K., Lee S.H., Park E.S., Hacımüftüoğlu A., Abd El-Aty A.M., Jeong J.H. Protectin DX Ameliorates Hepatic Steatosis by Suppression of Endoplasmic Reticulum Stress via AMPK-Induced ORP150 Expression. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2018;365:485–493. doi: 10.1124/jpet.117.246686. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
15. Jung T.W., Kim H.C., Abd El-Aty A.M., Jeong J.H. Maresin 1 attenuates NAFLD by suppression of endoplasmic reticulum stress via AMPK-SERCA2b pathway. J. Biol. Chem. 2018;293:3981–3988. doi: 10.1074/jbc.RA117.000885. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
16. Bando Y., Ogawa S., Yamauchi A., Kuwabara K., Ozawa K., Hori O., Yanagi H., Tamatani M., Tohyama M. 150-kDa oxygen-regulated protein (ORP150) functions as a novel molecular chaperone in MDCK cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2000;278:C1172–C1182. doi: 10.1152/ajpcell.2000.278.6.C1172. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
17. Shore G.C., Papa F.R., Oakes S.A. Signaling cell death from the endoplasmic reticulum stress response. Curr. Opin. Cell Biol. 2011;23:143–149. doi: 10.1016/j.ceb.2010.11.003. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
18. Parafati M., Lascala A., Morittu V.M., Trimboli F., Rizzuto A., Brunelli E., Coscarelli F., Costa N., Britti D., Ehrlich J., et al. Bergamot polyphenol fraction prevents nonalcoholic fatty liver disease via stimulation of lipophagy in cafeteria diet-induced rat model of metabolic syndrome. J. Nutr. Biochem. 2015;26:938–948. doi: 10.1016/j.jnutbio.2015.03.008. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
19. Yang L., Li P., Fu S., Calay E.S., Hotamisligil G.S. Defective hepatic autophagy in obesity promotes ER stress and causes insulin resistance. Cell Metab. 2010;11:467–478. doi: 10.1016/j.cmet.2010.04.005. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
20. Ahn D.K. Illustrated Guide to Clinical Medical Herbs. Hyeonamsa Publishing Co., Ltd.; Seoul, Korea: 2012. pp. 211–213. [Google Scholar]
Comments